高GC高保真酶-友名生物公司

低嚴格單鏈特異性引物pcr (lowstringencysingle specific primer pcr， lssp- pgr)技術
lssp - pcr是建立在pcr基礎上的又一種新型*突變檢測技術。要求是“二高一低”。高濃度的單鏈引物( 5-端/ 3-端引物均可).約4. 8lmol高濃度的taq酶( 16lmol/ 100ml) 低退火溫度( 300.所用的模板必須是純化的dna部分片段。在這種低嚴格條件下。引物與模板間發生不同程度的錯配。形成多種大小不同的擴增產物。經電泳分離后形成不同的帶型。對同一目的*而言。所形成的帶型是固定的。因而稱之為“*標簽”。這是一種檢測*突變或進行遺傳鑒定的快速敏感方法。
反向pcr( inverse pcr， ipcr術
原理:反向pcr是克1隆已知序列旁側序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無切點的限制性內切酶消化*組dna.后酶切片段自身環化.以環化的dna作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結合的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產物是線性的dna的部分片段，大小取決于.上述限制性內切酶在已知基閑側翼dna序列內部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內切酶消化，可以得到大小不同的模板dna，再通過反向pcr獲得未知片段。
該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，高gc高保真酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的dna部分片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶dna。②大多數有核*組含有大量中度和高度重復序列，而在yac或co*id中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向pcr得到的探針就有可能與多個*序列雜交。
巢式pcr(nest pcr枝術.
先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板量.然后再用一對內引物擴增以得到特異的pcr帶。此為巢式pcr。若用一條外引物作內引物則稱之為半巢式pcr。為減少 巢式pcr的操作步驟可將外引物設計得比內引物長些，且用量較少。同時在第yi次pcr時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度。這樣在第yi次pcr時，由于較高退火溫度下內引物不能與模板結合，故只有外引物擴增產物，經過若干次循環。待外引物基本消耗盡，無需取出第yi次pcr產物，只需降低退火即可直接進行pcr擴增。這不僅減少操作步驟。同時也降低了交叉污染的機會。這種pcr稱中途進退式pcr( drop-in， drop-out pcr)上述三種方法主要用于少量dna模板的擴增。
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